Purificación, caracterización y expresión heteróloga de la proteasa menor extracelular (Epr) de Bacillus licheniformis

Abstract

La cepa B. licheniformis USC13 aislada en nuestro laboratorio tiene la capacidad de producir un enzima que coagula la leche de modo natural. Guiados por el objetivo de conseguir nuevas fuentes de enzimas con aplicación a la industria de la quesería, se decidió estudiar y caracterizar este enzima de interés. Los estudios llevados a cabo permitieron establecer que el enzima responsable de este efecto es la proteasa menor extracelular (Epr). La proteasa Epr es una de las proteasas expresadas durante la fase estacionaria de crecimiento en B. subtilis, representando un 2-4% del porcentaje total de proteasas durante de esa fase, este enzima pertenece a la familia de peptidasas S8. No es necesaria para el crecimiento o la esporulación. Su expresión se ve inhibida catabólicamente por la acción de reguladores de estado de transición. Enzimáticamente, esta proteasa presenta inhibición por PMSF y, a pesar de no ser una metaloproteasa, es inhibida ante concentraciones elevadas de EDTA. Esta proteasa estar relacionada con el procesamiento de un factor de competencia implicado en el quórum sensing. Esta proteasa se expresa con una región inicial que funciona como chaperona y como un dominio inhibitorio (I9). Los inhibidores de peptidasas de esta familia pueden encontrarse como un dominio simple en la proteína, o bien como dominios simples o múltiples que no se encuentran dentro de una proteína. En muchos casos son sintetizados como parte de una proteína precursora más larga, tanto como un prepropéptido o como un dominio N-terminal asociado con la peptidasa inactiva. El mecanismo de acción de estos inhibidores es variado, algunos inhibidores interactúan directamente con las proteasas utilizando un sistema de cierre no covalente y un mecanismo de llave; otros inhibidores utilizan un sistema de cambio de conformación que altera su estructura y propiedades termodinámicas. La expresión de la proteasa Epr en B. subtilis está regulada por el promotor ¿D. Este promotor regula la motilidad y la producción de autolisinas implicadas en la separación celular y el mantenimiento de la heterogeneidad . La ¿proteasa menor extracelular¿ Epr se expresa en forma de prepropéptido, con un péptido señal Sec (PS) de 27 aninoácidos. Para poder estudiar este enzima se desarrollo un método de medición de actividad coagulante que permitiese realizar estudios cinéticos y de estabilidad. El método tradicional para evaluar un enzima coagulante es su incubación frente a leche. La coagulación de la leche es un fenómeno que se ve afectada por el pH y la temperatura, produciéndose de forma espontanea baja determinadas condiciones (pH bajo o elevadas temperaturas). Otro de los problemas que tiene esta determinación es que no es adecuada para enzimas que no tengan una actividad elevada, puesto que se determina el tiempo que se tarda en coagular, produciéndose muchas veces la coagulación incluso de los controles negativos. Por último, cabe destacar, que para el estudio de los parámetros cinéticos, es necesario utilizar diferentes concentraciones de sustrato, y en la coagulación de la leche es dependiente de la cantidad de sustrato. De este modo, no se producirá la coagulación en muestras de leche diluidas, dado que es necesario que las micelas de la leche se encuentren agregadas para que este proceso se dé lugar. El método propuesto, que dio lugar a una patente de la USC, se basa en la medición de la fluorescencia liberada por la degradación de la k-caseína marcada con Isotiocianato de fluoresceína. Los niveles de expresión del microorganismo de origen no son lo sufrientemente elevadas como para su uso directo. Además la producción de este enzima se ve acompañada por la de otros enzimas que producen la degradación de la masa quesera y olores desagradables. Se desarrollo una metodología para purificar el enzima y permitir su uso. El gen fue aislado y clonado en el vector pCR-BluntII TOPO, y de ahí se movilizó al vector de expresión pET30a. Esta construcción se expresó en la cepa BL21(DE3) de E. coli. Se consiguieron niveles de sobre expresión en bacteria, pero no se consiguió que las muestras tuviesen actividad significativa. La mayor parte de la proteasa expresada se acumuló en cuerpos de inclusión intracelulares, la purificación y solubilización de los mismos no consiguió la obtención de enzima activa. Se utilizaron diferentes estrategias para intentar aumentar la cantidad de enzima soluble. Para ello se realizaron expresiones a diferentes temperaturas, tiempos y concentraciones del inductor. Se pudo observar que la cantidad de proteasa soluble aumenta cuando la temperatura de expresión se baja. Del mismo modo, se pudo observar que a 37º C la banda de expresión del enzima se desdobla en dos bandas, posiblemente por proteólisis de la muestra. Para la estrategia de expresión en levadura la construcción se movilizó al vector de expresión pHILS1 de P. pastoris. Los estudios de expresión inducible con metanol consiguieron la producción de enzima activa, pero esta no llegó a acumularse por un proceso de proteólisis. Este mismo resultado se pudo observar en la expresión de otros enzimas coagulantes Se realizó un estudio de modelado tridimensional de la estructura de la proteasa, llegando a la conclusión que el calcio representaba un papel fundamental, bien en el plegado o en la activación del enzima. Los estudios realizados en las muestras de cuerpos de inclusión tratados con calcio permitió la activación de enzima. Se pudo determinar que la activación del enzima requiere calcio, pero este no es adecuado para el plegado de la estructura, los estudios determinaron que el enzima sufre una pérdida de actividad cuando no tiene otro sustrato sobre el que actuar. El calcio que estabiliza la estructura del modelo de la proteasa produce que la región I9 se adentre en el centro activo de la proteasa durante la minimización del modelo. Se podría considerar que el modelo representa a la proEpr en el momento de la activación, puesto que la región I9 se encuentra dentro del centro activo, con lo que tendería a cortarse. El calcio representaría un nuevo nivel de control para la activación de este enzima, no encontrándose cantidades tan elevadas de calcio más que en la región ¿periplásmica¿, estando controlada por los niveles de ácido dipicolico, un quelante natural del calcio. El enzima Epr produce las masas queseras a partir de diferentes tipos de leche. Las masas queseras obtenidas con el enzima recombinante tienen unos patrones de proteína y grasa diferentes a las que presentan los enzimas comerciales y similares a las que presenta el enzima natural, si bien el proceso de coagulación sigue siendo lento. Los mejores resultados se obtuvieron al utilizar el enzima Epr y quimosina, siendo, en todos los aspectos, superiores a los controles y a las masas queseras obtenidas exclusivamente con el enzima recombinante. Con este uso combinado se obtienen unas masas queseras con unas mejores características y con una coagulación rápida. En un proceso industrial se debería incubar previamente la leche con la proteasa Epr y utilizar la quimosina como coagulante final.