Estudio de marcadores genéticos en poblaciones nativoamericanas y mestizas americanasaplicaciones forenses, poblacionales y en estudios de asociación

Abstract

¿ESTUDIO DE MARCADORES GENÉTICOS EN POBLACIONES NATIVOAMERICANAS Y MESTIZAS AMERICANAS: APLICACIONES FORENSES, POBLACIONALES Y EN ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN¿. Gloria Liliana Porras Hurtado Instituto de ciencias forenses Facultad de Medicina Universidade de Santiago de Compostela, Enero, 2011 INTRODUCCION Existe una reconocida asociación entre la diversidad genética y la distribución geográfica de los 5 grandes grupos poblacionales. Sin embargo la diversidad entre las poblaciones nativoamericanas y el este de Asia (fundadores iniciales de América), muestra grandes diferencias debido a una separación hace 15000 años aproximadamente. La pérdida de heterocigosidad por los efectos fundadores podría crear alelos fijos en una pequeña proporción de loci y este efecto ser más marcado en Americanos ya que ellos son el resultado de una serie de efectos fundadores más que cualquier otro grupo poblacional. Aunque para la valoración del flujo genético entre poblaciones siempre se han utilizado marcadores poblacionales como el cromosoma Y y el ADN mitocondrial. Los marcadores de cromosoma Y únicamente valoran las mutaciones para distinguir la diversidad de los haplotipos, menos diversos que los genotipos autosómicos y que además identifica sólo varones. Y el ADN mitocondrial que tampoco recombina, no segrega independientemente, da menor identificación de diversidad y sólo proporciona información por la vía materna. Ambos muestran un error en identificación geográfica por su pequeño tamaño efectivo poblacional, un cuarto del autosómico. Por otro lado los STRs autosómicos son muy variables entre individuos, aunque disminuye su variabilidad entre poblaciones no siendo ideales para predecir el origen de la población como Cromosoma Y y ADN mitocondrial, pero podría contribuir a diferenciar la fluctuación estocástica de frecuencias alélicas en una población dueña de variaciones en la contribución de cada individuo a la próxima generación. La introducción del proyecto HapMap abre puertas a nuevos marcadores autosómicos, del ADN mitocondrial y del Cromosoma Y como los SNPs con características específicas tales como su baja tasa de mutación, la identificación de heterocigosidad extrema por ser un marcador binario con representación en todas las poblaciones lo que los hace útiles en identificación geográfica, su distribución en todo el genoma y permitir la formación de grandes multiplexes con el análisis de pequeños amplicones importantes para muestras degradadas en una sola reacción. El multiplex 34plex específico para identificación geográfica basado en los datos de HapMap fue diseñado para diferenciar únicamente la procedencia europea, asiática o africana dejando de lado la población nativo americana y mestiza americana. Cuando se trata de aplicar esta técnica a una población mestiza como las americanas, con flujo genético durante 500 años entre nativo americanos, europeos y africanos nos encontramos con un fallo en la información obteniendo datos sesgados sobre ubicación geográfica, ubicándolos entre Asia y Europa negando una identificación exacta y propia; de aquí la necesidad de buscar marcadores específicos para América como se confirma con el STR D9S11 en el cuál el alelo 9 es específico americano permitiendo parcialmente una identificación geográfica. Con base en todo lo anterior podemos concluir entonces que la implementación y validación del ¿52plex¿ assay de identificación individual en laboratorios colombianos es un paso importante en el avance de la tecnología forense en Colombia, proporcionando una herramienta importante para la interpretación de casos complejos. Obtener frecuencias alélicas propias es importante para asegurar una buena calidad de la prueba. Con la implementación del 34plex assay para identificación geográfica se evidencia gran falta de información ya que ubica los individuos nativoamericanos como europeos asiáticos o africanos no como otro grupo poblacional, evidenciando la necesidad de un nuevo plex específico para admixture americana. De ello surge la necesidad de realizar un nuevo multiplex de SNPs en población nativo-americana para evidenciar las diferencias entre poblaciones e incorporar este conocimiento a la información que obtenemos con el ¿34 plex¿ para identificación geográfica Nosotros hemos recolectado un grupo de alrededor de 200SNPs mostrando diferencias en las frecuencias de los marcadores genéticos entre americanos y los otros 4 grupos poblacionales. De éstos nosotros hemos seleccionado 28 SNPs en un sólo ensayo de SNaPshot, que puede ser complementado con el test de ancestralidad 34plex existente. Los 28 SNPs ( pero más eficiente 28+34 SNPs) son informativos para asignar ancestralidad nativoamericana o diferenciar la compleja mezcla de componentes americanos, europeos y africanos resultado del proceso dominante en los últimos 500 años de demografía americana.Nosotros evaluamos la eficacia del multiplex en combinación con los test de SNPs informativos ancestralmente usando muestras de varias poblaciones nativoamericanas de Colombia, Venezuela y Guatemala, y otras poblaciones mestizas de Colombia, Venezuela, Guatemala, Chile y Brazil. Se realizó la clasificación basados en los 4 grandes grupos poblacionales obteniendo cero error de clasificación en la validación usando el 28+34plex. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Implementar marcadores de ancestralidad para poblaciones nativoamericanas y mestizas americanas en medicina forense y en estudios genéticos. OBJETIVOS ESPECIFICOS: Diseñar y estandarizar un nuevo multiplex de SNPs para ubicación geográfica específica para nativoamericanos y mestizos americanos. Genotipificar poblaciones nativoamericanas y mestizas americanas con este nuevo multiplex una vez estandarizado Genotipificar SNPs neutros para eliminar subestructuración en estudios de casos y controles suramericano. Validar los multiplex de SNPs para su utilización en muestras forenses RESULTADOS POR ARTICULOS 1. Polimorfismos genéticos de 15 loci STR en Colombia central y occidental (Publicado) Se analizaron 15 STR en 1944 individuos mestizos sanos procedentes de la región centro occidente colombiana importante para el uso rutinario en la identificación forense de la región, se encontraron distancias génicas significativas con las poblaciones de Brazil, Guatemala, Mexico. Se obtuvieron frecuencias alélicas importantes para el análisis de casos forenses 1. Variabilidad genética del panel de identificación SNPforID 52-plex en Colombia central y occidental (Publicado) La implementación y validación del 52plex assay en laboratorios colombianos es un paso importante en el avance de la tecnología forense en Colombia, proporcionando una herramienta importante para la interpretación de casos complejos, igualmente fue importante tener frecuencias alélicas propias para asegurar una buena calidad a la prueba. 2. D9S1120, un STR simple con un alelo común específico de Nativo-Americanos: optimización forense, caracterización del locus y estudio de las frecuencias alélicas (Publicado) En la búsqueda de marcadores ancestrales específicos de América se analizó el STR D9S1120 que exhibe un alelo específico de poblaciones de Siberia y América confirmando una de las rutas de migración analizadas mediante marcadores de Cromosoma Y y ADN mitocondrial. La reducción del amplicón para el análisis hace que este marcador no sólo sea útil para identificación forense sino también para estudios genéticos de poblaciones americanas. 3. PIMA: un multiplex basado en SNPs indicador de poblaciones Americanas (En proceso de publicación) Con la idea de construir un multiplex pequeño de SNPs autosómicos altamente informativos ancestralmente, flexible capaz de complimentar los marcadores uniparentales para el análisis de la variabilidad en las poblaciones nativoamericanas y mestizas americanas. Se desarrolló un multiplex de 27 SNPs que complemente el 34plex ya existente adquiriendo gran poder para analizar poblaciones americanas, se comprobó la capacidad del multiplex para ubicar la variabilidad entre las poblaciones analizando 14 poblaciones geograficas y culturalmente diversas de Suramérica y Centroamerica. 4. Prevalencia de alelos asociados al comportamiento adictivo y comparación entre adictos y no-adictos a opiatos o cocaína (En Proceso de Publicación) La farmacodependencia está influenciada por factores psico-sociales, fisiológicos, genéticos y farmacológicos. Parte de la investigación actual se enfoca en la búsqueda de marcadores genéticos que influyan en la vulnerabilidad para la adquisición de la adicción, su persistencia y la propensión a las recaídas, lo que redundará en una mejor fundamentación científica de los programas de prevención y atención de drogadictos. 5. Marcadores informativos de la ¿ancestralidad¿ (AIMs) y la diferenciación de la componente africana de ancestralidad para estratificar grupos en estudios de casos-control de una población urbana Brasileña ( En Proceso de Publicación) CONCLUSIONES Se analizaron 15 STR en 1944 individuos mestizos sanos procedentes de la región centro occidente colombiana utilizando el kit Identifiler lo que esencial para el uso forense de estos marcadores en la región. Se encontraron distancias génicas significativas con las poblaciones de Brasil, Guatemala y Mexico. Se analizaron en la misma población los 52 SNPs del multiplex desarrollado por el grupo europeo SNPforID obteniéndose las frecuencias alélicas de los polimorfismos incluídos en el mismo lo que esencial para su aplicación en casos prácticos en la población colombiana. Se diseñaron y validaron unos nuevos cebadores para el análisis del sistema STR D9S1120 que producen un tamaño del producto amplificado más pequeño, ideal para fines forenses en muestras degradadas. Se analizó este sistema en poblaciones nativoamericanas (maya, awa, pijao y coyaima) además de una población afrodescendiente (los Mulaló) y poblaciones mestizas colombianas encontrándose una frecuencia del alelo 9RA de 0,31 en las poblaciones nativoamericanas, un menor porcentaje en los mestizos y aún menor en la población Mulaló. El alelo 9RA es suficientemente frecuente en poblaciones americanas para ser utilizado como marcador informativo de ancestralidad, ya que es inexistente en el resto de las poblaciones. Investigando SNPs cercanos a este STR encontramos el SNP rs4877301 localizado a 633pb del mismo, y que muestra una divergencia importante del 0,33 entre las cuatro poblaciones HapMap convirtiéndose así en un candidato a la hora de buscar SNPs informativos de ancestralidad para americanos. Se ha desarrollado un múltiplex compuesto de 26 SNPs autosómicos, 1 SNP en el cromosoma X y 1 en el marcador de sexo amelogenina distribuidos a lo largo de todo el genoma estandarizados en un solo múltiplex llamado PIMA. Los SNPs utilizados fueron escogidos por ser informativos y discriminativos para un posible componente ancestral nativoamericano. Su uso puede ser complementario al 34plex (otro grupo de marcadores ancestrales desarrollados por el Instituto de Ciencias Forenses de la Universidad de Santiago) de modo que así los individuos pueden ser clasificados con insignificante error como pertenecientes a América, Asia, Europa y África. Los marcadores de PIMA detectan la diferenciación entre la población americana y los otros 3 grupos poblacionales y la adición del 34plex complementa la diferenciación para europeos. Es posible establecer una relación de proximidad entre poblaciones considerando sólo las cuatro principales poblaciones en este estudio. América está más cerca del este de Asia, explicado por el cuello de botella en el norte de Asia con el posterior aislamiento, luego Europa y por último África, lo que es consistente con la teoría de la migración ¿Out to Africa¿. Hemos medido los niveles de las distancias Fst entre las poblaciones americanas de referencia del panel CEPH (Pima, Surui y Karitian) y encontramos sólo 3 SNPs de nuestro panel PIMA con niveles de Fst detectables más grandes que el promedio (rs12402499, rs2051827 y rs16968965). Las matrices de Fst y las distancias génicas de Nei muestran una baja variabilidad en los 24 SNPs restantes entre las poblaciones americanas. La población Awa de Colombia puede ser considerada como no mezclada en comparación con las otras poblaciones americanas del panel CEPH (Pima, Surui y karitian) lo que coincide con la información obtenida con marcadores de cromosoma Y y del ADN mitocondrial. Se confirmó el gran componente africano que tiene la población afrodescendiente de Mulaló, ubicada en el centro de Colombia con un aislamiento cultural importante desde hace 200 años y que ha sido objeto de varios estudios culturales sociológicos y genéticos. La población de São Paolo (Brasil) es otra población en la cual encontramos un gran componente ancestral africano y europeo, mientras que las demás poblaciones urbanas mestizas de Colombia, Venezuela y Chile muestran un componente europeo mayoritario seguido por el componente nativoamericano. La población mestiza de la ciudad de Guatemala muestra un componente nativoamericano importante muy similar a la población nativoamericana Queqchi, también guatemalteca, analizada en este estudio. El análisis de la estratificación de la población es esencial en estudios de asociación y puede prevenir falsos positivos. El panel PIMA demostró ser un panel ideal para el control de estratificación en estudios de asociación realizados en poblaciones americanas