Study of the role of LPXTG proteins, wall teichoic acids and the global regulator rot in the biofilm formation proceess of "Staphylococcus aureus"

Resumo

Staphylococcus aureus es una de las bacterias que más frecuentemente causa infecciones nosocomiales asociadas al uso de catéteres, válvulas y otros tipos de implantes médicos. Sobre estos dispositivos, S. aureus es capaz de adherirse y multiplicarse formando comunidades bacterianas denominadas biofilms en las que las bacterias se desarrollan protegidas frente al sistema inmune y el tratamiento antibiótico. El crecimiento en biofilm supone un agravante de las infecciones desarrolladas por S. aureus porque facilita el desarrollo de infecciones crónicas muy difíciles de erradicar. La formación de biofilm en S. aureus se ha asociado tradicionalmente a la producción del exopolisacárido PIA, también denominado PNAG, cuya síntesis depende de las enzimas codificadas por el operón icaADBC. Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que la presencia de este exopolisacárido no es esencial para la formación de biofilm y que existen vías alternativas por las que S. aureus puede adherirse y desarrollar un comportamiento multicelular. En primer capítulo de esta tesis y con objeto de poder realizar un estudio comparativo de las propiedades que diferentes tipos de biofilm confieren a la población bacteriana, hemos identificado un aislado clínico de S. aureus (MRSA 132) capaz de producir un biofilm de naturaleza polisacarídica (PIA/PNAG) o de naturaleza proteica en función de las condiciones ambientales. La mutación sistemática de cada uno de los miembros de la familia de proteínas de superficie LPXTG en la cepa de S.aureus 132 nos permitió identificar que sólo las proteínas de unión a fibronectina (FnBPs) eran responsables del desarrollo del biofilm de naturaleza proteica. Estudios comparativos de la estructura del biofilm mediante microscopia electrónica de barrido han mostrado que en los biofilms dependientes de FnBPs las bacterias están estrechamente unidas entre si y no se detecta la presencia de material intercelular, mientras que en el biofilm de naturaleza polisacarídica las bacterias están embebidas en una abundante matriz extracelular. Por otro lado, experimentos realizados in vivo utilizando un modelo subcutáneo de infección asociada a catéter revelaron que en la cpa de S. aureus 132 la falta de FnBPs provoca una deficiencia significativamente mayor que la ausencia de PI/PNAG en la capacidad de desarrolla infecciones asociadas a biofilm. En el segundo capítulo hemos estudiado el papel que juegan los ácidos teicoicos (WTAs) en el anclaje del exoplosicárido PI/PNAG a la superficie celular bacteriana. El PIA/PNAG posee un carácter catiónico que contrasta con la electronegatividad de la pared celular de S. aureus. Los ácidos teicoicos son los principales responsables de la carga negativa neta de la pared celular de las bacterias Gram positivas. Por ello, nos planteamos que el anclaje del PIA/PNAG se podía producir mediante atracciones electrostáticas entre las cargas positivas del PIA/PNAG y las negativas de los ácidos teicoicos de pared celular (WTAs). Para estudiar esta hipótesis generamos mutantes carentes de WTAs en dos cepas de S. aureus genéticamente no relacionadas mediante deleción del gen tagO que codifica la primera enzima de la ruta biosintética de las WTAs. Los mutantes AtagO poseían una menor capacidad de adhesión primaria a superficies, tenían afectada la capacidad de formar biofilm tanto en condiciones estáticas como de flujo continuo y presentaban un mayor grado de agregación celular que era independiente de la presencia del exopolisacárido PIA/PNAG. Del mismo modo, la mutación produjo un aumento de la tasa de autolisis y de la sensibilidad frente a altas temperaturas. Contrariamente a lo esperado, no se encontraron diferencias significativas ni en los niveles ni en la fuerza de interacción del exopolisacárido PIA/PNAG con la superficie celular bacteriana entre las cepas salvajes y los mutantes AtagO indicando que los QTAs no son necesarios para el anclaje del exopolisacárido PIA/PNAG a la pared celular. Siguiendo con el estudio de los biofilms dependientes de PIA/PNAG hemos identificado un nuevo regulador involucrado en el proceso de formación del biofilm de S. aureus genéticamente no relacionadas entre si, tanto en condiciones estáticas como de flujo continuo. Los mutantes Arot presentaban una menor capacidad de adhesión primaria a superficies y acumulaban menos cantidad de exopolisacárido PIA/PNAG sin que la trascripción, ni traducción del operan icaADBC se encontrasen afectadas. El análisis transcriptómico global del mutante en rot realizado con microarrays de Affymetrix reveló que la ausencia de Rot induce la expresión de proteasas y disminuye la expresión de proteínas de superficie como proteína A, pero ninguno de estos factores parece ser responsable de la deficiencia en formación de biofilm. Finalmente, y a pesar del enorme solapamiento existente entre las cascadas de regulación de agr y rot, hemos visto que la función de Rot en el proceso de formación de biofilm no depende del sistema agr. En resumen, nuestros resultados ilustran la complejidad de los procesos de formación de biofilm donde complejas redes reguladoras pueden interactuar e incluso solaparse para facilitar a S. aureus el desarrollo de un modo de vida multicelular adaptado en características composición a las condiciones ambientales del medio.