Contribución de las alteraciones del metabolismo lipídico al desarrollo de esteatosis hepática en rata wistar con el envejecimiento. Papel de la señalización hipotalámica de leptina.

Resumo

El proceso de envejecimiento conlleva el desarrollo de múltiples patologías entre las que se puede destacar el síndrome metabólico por su elevada incidencia entre la población mundial. Este cuadro patológico se puede considerar el reflejo del declive metabólico asociado al envejecimiento y se origina por la pérdida de efectividad de los procesos de regulación del metabolismo que resultan en el desarrollo de sobrepeso, resistencia a insulina, dislipemia e hipertensión. Por todo esto, el síndrome metabólico constituye un grave factor de riesgo para el desarrollo de diabetes mellitus del tipo 2 y de enfermedades cardiovasculares [1, 2]. La esteatosis hepática, o acumulación excesiva de lípidos en el hígado, está considerada como la forma en la que se presenta el síndrome metabólico en este órgano. El origen de esta patología está muy relacionado con el sobrepeso, especialmente con la obesidad abdominal y con el flujo constante de ácidos grasos que se establece en esta situación desde los depósitos de grasa viscerales al hígado. En este tema, también se debe considerar la insensibilidad a leptina como una situación que precede al desarrollo de obesidad y esteatosis hepática; dado que cuando se pierde la capacidad de respuesta a esta hormona adipocitaria, que controla la ingesta y promueve el gasto energético, se produce la acumulación ectópica de grasas. Planteamiento y objetivos de la tesis Teniendo en cuenta que la leptina participa en la regulación del metabolismo de la glucosa en el hígado y considerando la participación esencial de este órgano en el control de la homeostasis de glucosa y lípidos en el organismo, se puede deducir la existencia de una importante asociación entre la esteatosis hepática, la resistencia a leptina y el desarrollo de problemas relacionados con la intolerancia a la glucosa, rasgo característico de la diabetes mellitus del tipo 2. La hipótesis que se plantea en esta tesis es que la disminución de la señalización de leptina a nivel del sistema nervioso central, supone el detonante del desarrollo de esteatosis hepática con el envejecimiento. Adoptando como modelo experimental a la rata Wistar, especie que tiende espontáneamente al incremento del peso corporal durante el envejecimiento y al desarrollo de resistencia a insulina a nivel central y periférico [3], se llevó a cabo un estudio de las alteraciones del estado basal del metabolismo de forma global y del hepático en particular surgidas durante el proceso de envejecimiento empleando ratas de 3 y 24 meses de edad, así como de la evolución de la funcionalidad de la leptina en cuanto a regulación del metabolismo a nivel del sistema nervioso central. En concreto se planteó como objetivo general de este trabajo: Analizar las condiciones fisiopatológicas que conducen a la acumulación intrahepática de grasa y dislipemias con el envejecimiento. Y se abordaron los siguientes objetivos específicos: Analizar el metabolismo hepático a nivel molecular para identificar posibles alteraciones que propician la acumulación de grasa en el hígado con el envejecimiento. Analizar el estado de activación de factores de transcripción y de genes involucrados en la estimulación de la lipogénesis y el metabolismo oxidativo de lípidos en el hígado en ratas envejecidas. Estudiar los efectos generales y antiesteatóticos de la infusión crónica de leptina intracerebroventricular en ratas de 24 meses de edad, comparando estos con los ya descritos para ratas de 3 meses de edad. Dilucidar si la disminución de la señalización central de leptina y de su capacidad de incrementar la actividad del sistema nervioso autónomo, repercute en la regulación de la capacidad lipogénica y de respuesta a insulina del hígado. De esta forma, se logró profundizar en el estudio de las alteraciones metabólicas que conducen al desarrollo de esteatosis hepática, de la implicación de la resistencia a leptina en este proceso y de la relación de ambas condiciones con la regulación de la homeostasis de la glucosa. Procedimientos experimentales Para realizar el estudio es diseñaron dos bloques experimentales; el primero basado en un modelo de envejecimiento compuesto por dos grupos de ratas Wistar de 3 y 24 meses de edad, y el segundo sometiendo a un tratamiento con leptina vía intracerebroventricular a otro bloque de animales equivalente al primero. Todos los animales se sacrificaron tras un periodo de 16 horas de ayuno nocturno. El tratamiento con leptina se llevó a cabo mediante la implantación de mini-bombas osmóticas en los ventrículos cerebrales [4]. La dosis administrada fue de 0.2 g leptina/día durante 7 días. A los animales tratados con leptina se les permitió el libre acceso a una dieta de laboratorio de composición estándar y al agua. Se establecieron dos grupos control a los que se les suministro suero salino en vez de leptina; uno de ellos también con libre acceso a la comida y otro al que se le restringió la ingesta equiparándola a la de los animales del grupo de leptina (alimentación tipo pair-feeding) con el fin de discernir entre los efectos específicos de la hormona y los derivados de la reducción de la ingesta. Para analizar la influencia de la leptina en la señalización de insulina en el hígado, se administró el séptimo día, insulina endovenosa (10 U.I / Kg de peso corporal) o suero salino durante 30 minutos y a continuación se sacrificaron los animales. En todos los casos, se realizaron determinaciones de hormonas y metabolitos de interés en sangre utilizando kits comerciales de ensayos enzimáticos y de tipo ELISA específicos para glucosa, ácidos grasos no esterificados, triglicéridos, colesterol, cuerpos cetónicos, insulina y leptina. Se determinó el contenido de TAG del hígado de ratas de 3 y 24 meses de edad mediante la realización de un estudio histológico en cortes de hígados y la tinción con el colorante para lípidos Oil-Red y se confirmó por métodos bioquímicos mediante la extracción de los lípidos totales y la determinación de los TAG con el empleo de kits enzimáticos. Se evaluó la capacidad oxidativa hepática mediante la determinación de la producción de 14CO2 por explantes de hígado incubados en presencia de 14C1-ácido palmítico durante 2 horas. Se prepararon extractos totales de hígado en los que se determinó la actividad de la peroxidación lipídica mediante la medición de la producción de especies reactivas al ácido tiobarbitúrico en medio ácido (TBARS). Adicionalmente, se realizó un fraccionamiento subcelular del extracto total para aislar fracciones enriquecidas en núcleo y citoplasma, empleados en el análisis por Western-Blot de proteínas de interés. Asimismo, se realizaron ensayos de PCR a tiempo real con el fin de analizar el grado de expresión génica de las proteínas de interés. Resultados más trascendentes y discusión Durante la caracterización inicial del grupo experimental se observó, que las ratas de 24 meses de edad presentan varias de las alteraciones que caracterizan al síndrome metabólico: incremento del peso corporal y del grado de adiposidad visceral, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y esteatosis hepática. Asimismo, estos animales muestran hiperleptinemia y una disminución de la concentración plasmática de cuerpos cetónicos (Tabla 1, Tabla 2 y Figura 1). El estudio a nivel molecular del estado basal del metabolismo hepático permitió la identificación de alteraciones que conducen a la acumulación de lípidos en el hígado con la edad. En este grupo experimental, la capacidad del hígado para capturar glucosa y ácidos grasos aumenta en los animales de 24 meses de edad en comparación con los de 3 meses de edad, como consecuencia del aumento de la expresión génica de las enzimas glucoquinasa (GK), que propicia la asimilación de glucosa en respuesta a la insulina, y del transportador de ácidos grasos CD-36 que facilita la entrada de ácidos grasos libres a las células (Figura 2). Esta tendencia mantiene elevado el estado energético del hígado durante el ayuno, lo que disminuye el contenido de los sensores del estado energético SIRT-1 y AMPK (Figura 3) y dirige el metabolismo hepático hacia la formación y almacenamiento de lípidos, actividad más propia de los estados posprandiales. Concretamente, tanto los procesos de glucolisis como los de síntesis de ácidos grasos se encuentran estimulados a nivel transcripcional, observándose incrementos de la expresión de la acetilcoenzima A carboxilasa (ACC), el complejo ácido graso sintasa (FAS) y la estearoil coenzima A desaturasa (Scd-1) (Figura 4); lo cual favorece la transformación de la glucosa en ácidos grasos. Lo mismo sucede con la síntesis de triglicéridos catalizada por las enzimas diacilglicerol aciltransferasas 1 y 2 (DGAT-1 y 2) que muestran una mayor expresión génica con la edad (Figura 2). En este sentido, consideramos que es importante la participación del factor de transcripción ChREBP, cuya actividad se incrementa en el hígado como consecuencia de la elevada captura de glucosa, presentando un mayor grado de expresión génica y una localización subcelular mayoritaria en el núcleo de las células, donde estimula la expresión de las enzimas involucradas en los procesos glucolíticos-lipogénicos (Figura 5). Confirmando esta idea, existen evidencias en la literatura de ChREBP como promotor principal de la lipogénesis y regulador del metabolismo hepático [5, 6]. Además, dado que la expresión incrementada de ACC, FAS y SCd-1 se asocia a la disminución del tono simpático del hígado [7, 8], se sugiere este mecanismo como desencadenante de la acumulación intrahepática de grasas con el envejecimiento. Como consecuencia del elevado estado energético del hígado, los procesos de metabolismo oxidativo de ácidos grasos no se encuentran estimulados durante el ayuno, lo que se ve reflejado en la disminución de la expresión génica y de la localización nuclear del factor de transcripción Foxa- 2. Este factor regula la expresión génica de enzimas participantes en procesos del metabolismo oxidativo de ácidos grasos como la ß-oxidación y la cetogénesis (Figura 6). Dichas adaptaciones metabólicas, contribuyen a la acumulación de lípidos en el hígado, que a su vez conlleva el aumento de la secreción de lipoproteínas VLDL, proceso dependiente, en gran medida, de la disponibilidad de sustratos y en el que participa la enzima MTTP, cuya expresión génica se ve incrementada en estos animales (Figura 2), suponiendo así el origen de la hipertrigliceridemia observada. La posible inhibición del tono simpático en el hígado y el tejido adiposo con el envejecimiento, disminuiría igualmente la lipolisis y el metabolismo oxidativo de ácidos grasos del hígado así como la producción de cuerpos cetónicos, lo que se ve reflejado, en la disminución de la concentración de estos metabolitos en la sangre de estos animales (Tabla 2). A pesar de esto, se ha observado en las ratas de 24 meses de edad un aumento de la oxidación completa de ácidos grasos capturados por el hígado, mediante la elaboración de un ensayo de evaluación de la producción de CO2 en explantes de hígado incubados en presencia de ácido palmítico (Figura 7). Estos resultados coinciden con estudios realizados en humanos que demuestran que en individuos obesos la oxidación hepática de ácidos grasos provenientes de la dieta se encuentra incrementada [9, 10]. En relación a la sensibilidad a insulina, se confirma en este trabajo que la glucemia y la insulinemia en el estado de ayuno son normales en las ratas de 24 meses de edad (Tabla 2), a pesar de que estos animales desarrollan resistencia a insulina a nivel periférico con la edad, según lo descrito previamente [11, 12]. Puede asumirse que un aumento en la captura de nutrientes por parte del hígado, compensará la reducción de la asimilación de glucosa y ácidos grasos por el tejido adiposo y el músculo resistentes a insulina. Asimismo, el derivado incremento de la reserva de glucógeno hepática que se observa en estos animales (datos no mostrados), hace que se reduzca la necesidad de síntesis de nueva glucosa hepática. De hecho, en ayunas, la presencia del factor de transcripción Foxo-1a (estimulador de la gluconeogénesis) en el núcleo celular disminuye con la edad, localizándose mayoritariamente en el citoplasma donde permanece inactivo (Figura 8). Esta inactivación de Foxo-1a, que se produce en respuesta a insulina, podría derivar de los periodos de hiperinsuliemia posprandiales que se producen en las ratas de 24 meses de edad [11, 12]. Apoyando esta suposición, se ha observado en estos animales un aumento de la señalización de insulina en el hígado en respuesta inmediata a insulina [13]. Por otro lado, se debe tener en cuenta que el incremento de los niveles plasmáticos de leptina que presentan las ratas de 24 meses de edad no se traduce, aparentemente, en la estimulación endocrina del metabolismo oxidativo de lípidos en el hígado, como sería de esperar y a pesar de que la vía de señalización intracelular de la leptina en el hígado presenta un estado de activación mayor, en concordancia con los niveles plasmáticos de la hormona, observándose un aumento del contenido hepático del receptor de leptina ObRb, así como de la activación por fosforilación del efector de la señal de la hormona, el factor de transcripción STAT-3 (Figura 9). Esta vía podría inhibir en cierta medida la producción hepática de glucosa. No obstante, la disminución del tono simpático en las ratas envejecidas puede dirigir el metabolismo hepático hacia la acumulación de energía, e imperar sobre las funciones de la vía de señalización de leptina en el hígado. Por otra parte la resistencia central a leptina que exhiben estos animales [14] disminuye la capacidad de la hormona de estimular la vía simpática que inerva al hígado a través de los circuitos neuronales apropiados, facilitando el desarrollo de esteatosis hepática en situación de obesidad y envejecimiento. Además, se puede considerar que a pesar de la resistencia central a leptina, la hiperleptinemia que exhiben los animales de 24 meses de edad, podría moderar en cierta medida, la conducta alimentaria en estos animales, provocando la reducción de la ingesta diaria en comparación con los animales jóvenes (Tabla 1). A la vista de esta observación, no se puede establecer que este grupo experimental de ratas de 24 meses de edad haya desarrollado una resistencia global a las acciones de la leptina, a pesar del aumento de adiposidad y de la acumulación de lípidos en el hígado. Aun así, de los resultados obtenidos en este trabajo, así como de otros publicados con anterioridad [14], se deduce que existen limitaciones en el potencial de acción de la hormona y se planteó la posibilidad de que sea la insuficiencia de leptina la que produce menor señalización a través del sistema nervioso central en las ratas envejecidas. Con el fin de evaluar la capacidad de acción de la leptina a nivel del sistema nervioso central, de forma global y en lo referido a la acumulación intrahepática de grasa, parte de los estudios se realizaron en ratas de 24 meses de edad sometidas a un tratamiento de administración de leptina vía intracerebroventricular. De forma general, se puede establecer que la infusión de leptina en los ventrículos cerebrales se tradujo en la amplificación de las acciones más conocidas de la hormona. En este sentido, el tratamiento crónico (7 días) con leptina central, redujo aún más la ingesta alimentaria diaria de los animales, lo cual propició la disminución de su peso corporal (Tabla 3). Asimismo, en los animales tratados con leptina, disminuyó de forma significativa, la expresión hepática de ACC, FAS y Scd-1 (datos no mostrados) y el contenido de triglicéridos en este órgano (Figura 10), a la vez que aumentó la lipolisis del tejido adiposo y por tanto la liberación a la circulación sanguínea de ácidos grasos no esterificados que pueden ser asimilados por el hígado y otros tejidos. El aumento de estos sustratos cetogénicos en el hígado, así como la estimulación mediada por leptina de la transcripción de genes involucrados en la cetogénesis, condujo al aumento de la concentración plasmática de cuerpos cetónicos (Tabla 4), sin desarrollo de cetosis ni aumento de la peroxidación lipídica en el hígado de estos animales; de hecho, los niveles de TBARS disminuyen significativamente en el hígado de las ratas tratadas con leptina como consecuencia de la reducción de la ingesta (Figura 11). A la vista de estos resultados, se deduce que gran parte de las acciones que la leptina ejerce a través del sistema nervioso central, relacionadas en gran medida, con la activación del tono simpático [7] conservan su funcionalidad en las ratas envejecidas aunque requieren de niveles mayores de leptina en las áreas cerebrales. No obstante, es importante destacar que todas las modificaciones observadas con el tratamiento de leptina son de menor magnitud a las descritas con anterioridad en animales jóvenes [4]. A partir de los resultados descritos en este trabajo, se puede sugerir que la resistencia central a leptina que se observa en las ratas de 24 meses de edad, podría deberse, en parte, a la necesidad de incrementar sus niveles en los ventrículos cerebrales, más que a una pérdida de funcionalidad de las vías de señalización. Confirmando esta hipótesis, se ha observado que la presencia del receptor de leptina ObRb en el cerebro de las ratas de 24 meses de edad tratadas de forma crónica, con leptina central, se ve incrementada en comparación con el grupo Pair Feeding (Figura 12). La insuficiente presencia de la leptina en los ventrículos cerebrales puede justificarse por la naturaleza saturable del proceso de transporte de la hormona a través de la barrera hematoencefálica que además se ve desfavorecido por la hipertrigliceridemia que presentan los animales de 24 meses de edad. Finalmente, los estudios de los efectos de la administración central crónica de leptina sobre la acción de insulina en el hígado in vivo, demuestran que en las ratas de 24 meses de edad, el tratamiento con leptina central no parece incrementar la sensibilidad global a la insulina, al observarse un aumento de la concentración de insulina plasmática durante el ayuno respecto al grupo Pair Feeding que exhibe niveles bajos de la glucemia (Tabla 4). Con relación a este fenómeno, se ha comprobado que en los animales de 24 meses de edad el contenido en el hígado de los efectores de la vía de señalización de la insulina, IRS-2 y AKT-2, se encuentra disminuido en relación a lo observado en ratas de 3 meses de edad (Figura 13). Se puede sugerir que la disminución de IRS-2 esté relacionada con los altos niveles de SOCS-3 (proteína que promueve la degradación de IRS-2), que se observan en el hígado de ratas viejas, que puede provenir de un exceso de activación de las vías de señalización intracelular de la leptina y la insulina (Figura 9). Asimismo, la activación de IRS-2 por fosforilación en tirosinas mediado por la insulina, se ve reducida en los animales hiperleptinémicos de 24 meses de edad y en los tratados con leptina central y esto se produce igualmente en animales de 3 meses de edad (Figura 13), lo que indica que la leptina, a través de los circuitos centrales, modula la señalización de la insulina en el hígado, al menos la que se produce a través de la vía IRS2/AKT2, de modo que reduciría el exceso de señalización de la insulina que también se considera un factor desencadenante de esteatosis hepática [15, 16]. Globalmente, los resultados obtenidos permiten sugerir que la disminución del tono simpático del hígado con el envejecimiento aumenta su capacidad de almacenamiento de energía, lo que produce esteatosis hepática. Que la insuficiente señalización central de leptina es parte del mecanismo que disminuye el tono simpático del hígado en las ratas viejas. Que la hiperleptinemia (acciones directas de leptina sobre el hígado) podría limitar en cierta medida, las acciones de la insulina sobre este órgano en animales con resistencia a insulina del tejido adiposo y algunos músculos y además podría colaborar en la homeostasis de glucosa. Que la naturaleza saturable del proceso de transporte de la leptina plasmática a través de la barrera hematoencefálica, impedido además por la hipertrigliceridemia, limita la capacidad de acción de la hormona en el hígado a través del sistema nervioso central y autónomo, a pesar de la elevación de sus niveles plasmáticos lo cual propicia el incremento de la lipogénesis en el hígado. Que en las ratas viejas la infusión de leptina en el cerebro y el aumento de la señalización central de leptina incrementan el tono simpático del hígado, reducen la esteatosis y regulan la glucemia. (Esquema 1). Conclusiones: 1.- En las ratas Wistar de 24 meses de edad el aumento de la adiposidad visceral y la resistencia a insulina del tejido adiposo y del músculo provocan el incremento del flujo de nutrientes hacia el hígado que los asimila y los almacena en forma de lípidos. 2.- El envejecimiento en la rata Wistar se caracteriza por disminución del tono simpático del hígado (y del tejido adiposo). Esta situación dirige el metabolismo hepático hacia los procesos de formación y almacenamiento de lípidos en detrimento de los de movilización de la reserva energética. 3.- Con el envejecimiento se requiere más leptina en los núcleos hipotalámicos y cerebrales para la adecuada transmisión de señales de esta hormona adipocitaria y su repercusión sobre los tejidos periféricos. 4.- La infusión central de leptina en ratas viejas, incrementa el tono simpático del hígado, de modo que disminuye su capacidad lipogénica, a la vez que se incrementa su capacidad de distribución de las grasas hacia tejidos extrahepáticos por lo que disminuye la esteatosis hepática. 5.- La disminución de la esteatosis hepática en las ratas de 24 meses de edad, tratadas con leptina, se produjo sin incremento en los niveles de peroxidación lipídica en el hígado. 6.- La leptina a través del sistema nervioso central podría modular ciertas acciones de la insulina y el glucagón en el hígado de las ratas envejecidas que repercuten en el control de la glucemia. 7.- La disminución del tono simpático y de las acciones de la leptina y la insulina forman parte del proceso de envejecimiento, que en estos animales produce esteatosis hepática y dislipemia antes que intolerancia a la glucosa y diabetes mellitus. Recomendaciones: La rata Wistar al envejecer desarrolla esteatosis hepática e hiperlipemias sin que muestre signos relevantes de resistencia a la insulina en el hígado. Los resultados de este trabajo sugieren que la esteatosis se desarrolla debido al incremento en la capacidad lipogénica del tejido que se deriva de la disminución del tono simpático de este órgano con el envejecimiento. Teniendo en cuenta que las secreciones de insulina en estos animales compensan la insensibilidad a esta hormona de tejidos como el adiposo blanco y algunos músculos, en estas circunstancias, las acciones lipogénicas de la insulina en el hígado se ven favorecidas. Se sugiere adoptar medidas que ayuden a preservar o incrementar la señalización, a nivel central, de aquellos factores que estimulan la actividad del sistema nervioso autónomo, como por ejemplo la leptina, para impedir el desarrollo de esteatosis hepática y sus consecuencias durante el envejecimiento.