Trioquinasa - fmn ciclasaun producto del gen humano dak con actividades quinasa y liasa ciclante distinguibles por mutagénesis dirigida

Resumo

La trioquinasa (TK; EC 2.7.1.28) es la tercera enzima de la vía de Hers para el metabolismo hepático de la fructosa: el grupo 1-OH de la fructosa es fosforilado por la fructoquinasa, el producto fructosa-1-fosfato es convertido en dihidroxiacetona-fosfato y D-gliceraldehído por la aldolasa B, y finalmente el D-gliceraldehído es fosforilado a D-gliceraldehído-3-fosfato por TK. Esta enzima también fosforila dihidroxiacetona, aunque dicha reacción no forma parte de la vía de Hers. De las tres enzimas, TK es la única que permanece sin identificar molecularmente, sin clonar y sin asignar a ningún gen animal o humano de manera concluyente. La FAD-AMP liasa ciclante o FMN ciclasa (FC; EC 4.6.1.15) es una fósforo-oxígeno liasa que cataliza reacciones intramoleculares de algunos compuestos ribonucleósido-difosfato-X (NDP-X), formando un fosfodiéster cíclico de X de 5 átomos (P<X) y un ribonucleósido-monofosfato (NMP). Aunque FC actúa sobre varios NDP-X, lo hace con una notable especificidad, pues sólo cataliza reacciones en las que P<X es un monociclo o una fusión bicíclica fosfodiéster-piranosa de configuración cis, no de configuración trans. Así, FC ataca NDP-glucosa y GDP-¿-L-fucosa, pero no NDP-manosa ni GDP-ß-L-fucosa. Además, al comparar las eficacias catalíticas de FC sobre 11 sustratos diferentes, los mejores son, con diferencia, FAD y ADP-glucosa. Puesto que el último no aparece en mamíferos, la enzima se nombra por su actividad sobre FAD, que da como producto P<X riboflavina 4',5'-fosfato cíclico (cFMN), de función desconocida, pero hallado en diversas fuentes, entre ellas hígado de rata. Este trabajo se inició para identificar y clonar molecularmente la proteína responsable de la actividad FC. Partiendo de la enzima purificada de hígado de rata, se obtuvo una huella peptídica por digestión con tripsina y espectrometría de masas MALDI-TOF, que apuntaba a una proteína hipotética catalogada como dihidroxiacetona quinasa por su homología secuencial con una enzima de levadura. La proteína de rata presentaba un homólogo humano muy parecido, también hipotético, por lo que su secuencia codificadora se empleó para diseñar un experimento de PCR dirigido al cDNA humano. Éste se clonó de cDNAs de encéfalo y se subclonó en un vector de expresión. La proteína expresada en Escherichia coli fue identificada enzimáticamente como FC e, inesperadamente, como TK, de aquí la denominación hTKFC. Los principales resultados de su estudio fueron los siguientes. (a) La proteína hTKFC bifuncional expresada en E. coli presentó las características enzimáticas conocidas de la FC de rata y de la TK de diversas especies animales. (b) Estudios de inhibición demostraron que los sustratos de TK inhiben a la actividad FC y viceversa, con características compatibles con una coincidencia parcial de los centros responsables de ambas actividades. (c) Se identificó al gen humano DAK como codificador de la proteína hTKFC y de una variante de procesamiento, enzimáticamente inactiva, generada por un sitio 3' alternativo para la eliminación del último intrón de dicho gen. (d) Se estudiaron los perfiles de expresión del gen DAK en tejidos humanos y de su ortólogo Dak en tejidos de ratón, mediante prospecciones bioinformáticas, analizándose sus correlaciones con el papel de la TK en la vía de Hers, así como las diferencias respecto a los perfiles de expresión de los genes codificadores de las otras dos enzimas de la vía, diferencias que apoyan que, además del metabolismo de fructosa, hTKFC puede tener otra función biológica. (e) Se estableció que las dos isoformas generadas por el procesamiento alternativo del último intrón del gen DAK tienen diferentes perfiles de expresión en tejidos humanos, evaluados por análisis de Northern con sondas oligonucleotídicas específicas. (f) Se comparó la secuencia de la proteína hTKFC con las de sus homólogos en organismos eucariotas y procariotas, y su estructura tridimensional teórica con la determinada experimentalmente por otros autores para la dihidroxiacetona quinasa de Citrobacter braaki (cepa inicialmente clasificada como perteneciente a la especie C. freundii), comparaciones que revelaron la conservación de aminoácidos implicados en el centro activo de la actividad quinasa, incluyendo un residuo de histidina (H221 en hTKFC) con el cual los sustratos dihidroxiacetona y gliceraldehído forman un enlace covalente durante la catálisis. (g) Teniendo en cuenta que estas triosas producen una inhibición sólo parcial de la actividad FC, y que ello indica que H221 podría no intervenir en la actividad FC, se prepararon y expresaron los mutantes H221A y H221E de hTKFC, que dieron lugar a enzimas que conservaban la mayor parte de la actividad FC y habían perdido la actividad TK, demostrando que ambas actividades son funcionalmente separables con el cambio de un único aminoácido.