Identificación de nuevos Biomarcadores de la Condrogénesis de células madre mesenquimales de pacientes con artrosis mediante Técnicas Proteómicas

Resumo

La capacidad de diferenciación de las células madre mesenquimales (MSCs) hacia condrocitos, en un proceso conocido como condrogénesis, concede a estas células un gran potencial terapéutico para la reparación de los defectos del cartílago característicos de enfermedades reumáticas como la artrosis. Sin embargo los mecanismos moleculares que participan en este proceso de diferenciación no son del todo conocidos. las técnicas proteómicas posibilitan analizar globalmente la actividad celular, ya que permiten obtener perfiles proteicos que proporcionan Información sobre las conexiones existentes entre las proteínas y las rutas o procesos celulares en las que participan. En este trabajo se han empleado diferentes metodologías proteómicas para estudiar los mecanismos moleculares que participan en la diferenciación condrogénica de las MSCs obtenidas de médula ósea, con el fin de identificar nuevos marcadores condrogénicos que puedan emplearse en la monitorización de terapias celulares encaminadas a la reparación del cartílago. Inicialmente se estandarizó el marcaje metabólico SILAC en MSCs aisladas de médula ósea para llevar a cabo los estudios proteómicos cuantitativos. Una vez optimizado este método, su aplicación nos permitió describir las proteínas intracelulares cuya abundancia se altera durante el proceso de diferenciación de las MSCs. Los niveles de expresión de 65 proteínas se modularon significativamente entre los dos estadios celulares analizados (indiferenciado (día 2) y diferenciado (día 14)). La mayor parte de estas proteínas estaban involucradas en el metabolismo celular y en la glucólisis. En base a este trabajo, decidimos realizar otro estudio en el que aplicamos el doble marcaje SILAC seguido de un análisis nanolC-ESI-MS para identificar y cuantificar las proteínas secretadas por las MSCs a los dlas 2 y 14 del proceso condrogénico. Mediante esta estrategia, se detectaron cambios significativos en la abundancia de 34 proteínas entre los dos tiempos analizados. la mayor parte de las protelnas aumentadas a día 14 son proteínas relacionadas con la matriz extracelular del cartílago, y entre ellas validamos mediante inmunoensayo el incremento de proteoglicano 4 (PRG4)y TIMP1 como potenciales biomarcadores de diferenciación condrogénica.Finalmente, se comprobó la utilidad de las técnicas de imagen mediante espectrometría de masas (MS Imaging) para la caracterización de lipldos involucrados en el proceso de diferenciación. En este último estudio demostramos que las MSCs metabolizan la esfingomielina durante la diferenciación condrogénica, V que la fosfocolina V sus derivados son posibles marcadores de indiferenciación de MSCs