Biomarker search in rheumatic diseases through conventional and emerging proteomic technologies

Resumo

Hai máis de 200 enfermidades reumáticas, que son a segunda causa de incapacitación a nivel mundial e afectan a preto de 2.000 millóns de persoas, principalmente mulleres. Esta tese céntrase especialmente en dúas das máis comúns: a artrose (OA) e a artrite reumatoide (RA). A pesar das diferenzas entre elas, todas producen síntomas similares (dor, rixidez e incluso perda de funcionalidade articular), aínda que os actuais diagnósticos e tratamentos son limitados. O diagnóstico estándar inclúe o uso de técnicas de imaxe, que poden ser prexudiciais para o paciente, e a análise de marcadores non específicos. O tratamento da OA está dirixido a aliviar a dor e mellorar a funcionalidade das articulacións, podendo incluso ser necesaria a substitución articular; mentres que o da RA inclúe varias estratexias terapéuticas mediante proba-erro. Debido a estas limitacións no diagnóstico e tratamento, hai unha gran necesidade de atopar biomarcadores que faciliten a comprensión dos procesos patolóxicos que teñen lugar co fin de especificar mellor o diagnóstico e o tratamento eficaz para o manexo destas enfermidades. Particularmente, nesta tese, realizáronse diferentes estudos proteómicos baseados na espectrometría de masas (MS) e inmunoensaios, co fin de atopar proteínas con potencial papel biomarcador en RA e OA e facilitar así a súa clasificación, diagnóstico e posterior selección de terapias eficaces. No primeiro estudo, levouse a cabo a busca dun panel de proteínas biomarcadoras para controlar a actividade da enfermidade en pacientes con RA, unha das principais limitacións para a correspondente selección de terapias eficaces e específicas que axudan a remitir os característicos episodios agudos desta patoloxía. Inicialmente, un grupo de 11 proteínas candidatas foi identificado por MS e cuantificación relativa co etiquetado de iTRAQ, en mostras de plasma agrupadas e deplecionadas de pacientes con RA con actividades de enfermidade extrema. Para confirmar a tendencia destas 11 proteínas, analizáronse 80 mostras plasmáticas individuais de pacientes con RA con diferentes actividades de enfermidade mediante MS dirixida, coa axuda de péptidos marcados estándar, das que 5 verificáronse como biomarcadores potenciais. Finalmente, 4 delas (SAA1, AACT, HPT e A1AG1) foron validadas por ELISA en 420 mostras de plasma de pacientes con RA, doantes sans e controis doutras enfermidades análogas. Así, este panel validado podería ser útil para o diagnóstico de enfermidades reumáticas inflamatorias autoinmunes como a RA e o seguimento da actividade da enfermidade, crucial para un seguimento e tratamento adecuados. No segundo e terceiro estudos, leváronse a cabo dous tipos diferentes de técnicas proteómicas máis emerxentes para atopar biomarcadores na OA. Por unha banda, leváronse a cabo dous estudos peptidómicos independentes mediante MS en secretomas de cartilaxe e en mostras de líquido sinovial e soro de pacientes con OA e doantes sans. A peptidómica pode ser de grande interese na OA, xa que a deterioración da cartilaxe está ligada a diversos procesos, entre os que destaca a acción das proteasas que producen neopéptidos con posible papel biomarcador para o diagnóstico ou o seguimento da OA. Así, 8 neopéptidos de PRELP, CLUS, CILP1, COMP e MGP víronse significativamente alterados nos secretomas de cartilaxe de pacientes con OA, cuxa liberación parece depender tamén da articulación afectada. Ademais, 6 neopéptidos pertencentes a APOA4, ITIH4, CO3 e KNG1 mostráronse alterados en mostras séricas agrupadas de pacientes con OA e doantes sans, aínda que neste caso non se realizaron análises estatísticas confirmativas. Doutra banda, desenvolvéronse dúas técnicas híbridas de inmunoafinidade acopladas a espectrometría de masas (IA-MS) para a detección de dúas proteínas de cartilaxe específicas (CILP1 e PRG4) en mostras de soro. Elaborouse un ensaio inmuno-MALDI (iMALDI) para a detección de PRG4 e outro de SISCAPA-MRM para a análise de CILP1. Aínda que a tendencia destas proteínas vese aumentada en pacientes con OA fronte a controis saudables, esta alteración non se fai significativa na pequena cohorte de mostras de soro analizadas.