Análisis del daño radioinducido en secuencias específicas de ADN satélite humano

Resumo

La interacción de las radiaciones con los organismos puede tener una gran relevancia tanto en ellos mismos como en su progenie. La principal diana en cuanto a relevancia biológica es el ADN. Ya sea de forma directa o indirecta (por medio de derivadosde la radiolisis del agua), los fenómenos de ionización y/o excitación alteran el ADN modificándolo. Entre las principales alteraciones, destacan las roturas de cadena sencilla y de doble cadena. Hasta ahora, ninguna de las técnicas existentes para el análisis de roturas en el ADN, permitía estudiar la heterogeneidad de respuesta celular ante los distintos agentes, en secuencias específicas. Este trabajo desarrolla una técnicas sencilla que permite estudiar las roturas presentes en el ADN en áreas concretas. Denominada DBD-FISH (DNA Breakage Detection- FISH), esta técnica morfológica aúna las técnicas de Microgeles, Unwinding (desenrollamiento) alcalina, y FISH. Las células a estudio se aíslan y mezclan con agarosa de bajo punto de fusión. Se crea un microgel sobre un portaobjetos y se somete a una solución de lisis para generar un nucleoide (estructura de ADN residual desorganizada, sin proteínas). A partir de los extremos de rotura y por acción del álcali, se genera ADN de cadena sencilla (ADNcs). Se restringe al máximo posible este ADNcs al lugar de rotura por ajuste de tiempos de exposición alcalina. A continuación se realiza una hibridación in situ con diferentes sondas específicas sobre estas dianas. Con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta densidad, se capturan las señales emitidas por las sondas. A mayor cantidad de roturas, más cantidad de ADNcs se genera, y por lo tanto habrá más diana sobre la que hibridar las sondas marcadas. Con un programa informático se cuantifica la señal y se analizan diferentes parámetros con un paquete estadístico. La intensidad total será el reflejo de la cantidad de roturas existentes en la zona concreta a estudio. Además de determinar la radiosensibilidad en diferentes regiones del genoma, la DBD-FISH, permite determinar la presencia de lugares lábiles alcalinos, así como las diferentes señales basales para distintas secuencias y el fenoma considerado en su conjunto. Nos encontramos por ejemplo, que los satélites clásicos de la familia de 5pb, presentan un elevado marcaje basal por ser ricos en lugares lábiles al álcanil. Por oro lado, permite analizar cuál es la protección ejercida por la estructura cromatínica sobre las secuencias estudiadas (satélite clásico, satélite alfoide, telómeros …) frente a las radiaciones y al álcali.