Desarrollo de un sistema de purificación de Isopenicilina N. caracterización del transporte de éste y otros intermediarios de la ruta biosintética de beta-lactamas en los hongos productores "Acremonium chrysogenum" y "Penicillium chrysogenum"

Resumo

Las rutas biosintéticas de penicilinas y cefalosporinas han sido ampliamente estudiadas y están caracterizadas a nivel génico en su totalidad. El interés por estos antibióticos beta-lactámicos sigue siendo enorme a nivel industrial, por lo que se continúa su investigación, centrándose esta ahora en los procesos de transporte y regulación. En esta tesis doctoral se han abordado varios aspectos aún no aclarados sobre la isopenicilina N, intermediario clave en el estudio de las rutas biosintéticas de penicilinas y cefalosporinas. La isopenicilina N es el primer compuesto bioactivo que se forma en estas rutas, que hasta esta etapa son idénticas. Es a partir de isopenicilina N que las rutas se diferencian para la formación de penicilinas en Penicillium chrysogenum, y hacia cefalosporina en Acremonium chrysogenum. El primer objetivo que se abordó fue la obtención de un método de purificación rápido y eficiente a partir de caldos de cultivo de cepas de los hongos productores. El método que se desarrolló consta de cinco pasos: desproteinización, tres cromatografías clásicas de columna y purificación a homogeneidad con HPLC semipreparativo. La pureza de la isopenicilina N obtenida es de aproximadamente 95% y el rendimiento total de la purificación es de 20-25%. La obtención de gran cantidad de isopenicilina N permitió completar su caracterización espectroscópica con la realización de un 13C-RMN, realizar estudios de cinética de degradación a distintas condiciones de pH y temperatura, así como estudios que permitieron determinar las condiciones óptimas de almacenamiento de este compuesto. Con objeto de estudiar el tipo de transporte por el cual los intermediarios de la ruta biosintética de penicilina, ACV, 6-APA e IPN, son secretados al medio de cultivo, se realizaron estudios ¿in vivo¿ de dicho transporte desarrollando para ello las cepas adecuadas en cada caso de Penicillium chrysogenum. La principales conclusiones de este estudio fueron que el 6-APA difunde a través de la membrana plasmática y peroxisomal de forma dependiente del tiempo y de la concentración, que el ACV no difunde, por lo que requiere de un sistema de transporte activo para su exportación al exterior celular, y por último, que la isopenicilina N también requiere de un sistema de transporte que la incorpore al interior peroxisomal y otro que la secrete al medio. Finalmente, se ha empleado un sistema heterólogo para purificar la proteína codificada por el gen cefD1 con el fin de estudiar su actividad enzimática. Cuando se describió este gen por primera vez se le asignó la función de activar la IPN a su derivado acil-CoA en el sistema de epimerizacion de IPN a PN en Acremonium chrysogenum, Los resultados obtenidos en este trabajo conducen a proponer que la enzima CefD1 activa la IPN a su derivado isopenicilinil-CoA para que se pueda ser transportada hacia el interior peroxisomal.