La conexina-43 recluta a PTEN y Csk para inhibir la actividad oncogénica de c-Src en células de glioma y astrocitos

Abstract

[ES]Los gliomas son los tumores cerebrales más frecuentes y presentan, en general, muy mal pronóstico. A pesar de los avances en el estudio de esta patología, su tratamiento no ha conseguido incrementar la esperanza de vida de los pacientes diagnosticados con un glioma maligno en los últimos años. Una de las características de los gliomas es la alta actividad de c-Src (Du et al. 2009), una tirosina kinasa muy importante en la regulación del crecimiento y la proliferación celular, y una baja expresión de la conexina 43 (Cx43). La Cx43 pertenece a la familia de las conexinas, las proteínas que forman las uniones comunicantes entre las células. En concreto, la Cx43 es la isoforma más expresada en astrocitos. La Cx43 se considera una proteína supresora de tumores porque la restauración de este gen en las células tumorales y, por tanto, el restablecimiento de la comunicación intercelular, trae como consecuencia una disminución en la velocidad de proliferación y la desaparición del fenotipo neoplásico (Hirschi et al. 1996; Huang et al. 1998; Mehta et al. 1991; Naus 2002; Zhu et al. 1991). En trabajos previos de nuestro grupo se puso de relieve que la restauración de la Cx43 en células de glioma de rata C6 inhibe la actividad de este oncogén, lo que resulta el bloqueo del paso de la fase G1 a la fase S del ciclo celular a través del aumento de la expresión de p27 y p21 (Herrero-Gonzalez et al. 2010). Por ello, en este trabajo nos proponemos profundizar en el mecanismo molecular responsable de la inhibición de c-Src por la Cx43. Estudios previos de otros grupos han mostrado que la actividad de c-Src se regula mediante fosforilación por la enzima Csk (c-terminal Src kinase) y desfosforilación por proteínas tirosina fosfatasas como PTEN y PTPN 13 (Dey et al., Glondu-Lassis et al. 2008, Palmer et al. 2002). Por esta razón, se puede pensar que la Cx43 podría regular la actividad de c-Src a través de la regulación de dichas enzimas. Así, nuestra hipótesis de partida es que la interacción entre la Cx43 y c-Src promueve el reclutamiento de Csk y PTEN para regular la actividad oncogénica de c-Src. Nuestros objetivos concretos han sido: 1. Estudio de la participación de Csk (C-terminal Src kinase) en la fosforilación de c-Src en Tyr527 provocada por la Cx43. 2. Estudio de la participación de PTEN en la reducción de la fosforilación de c-Src en Tyr416 provocada por la Cx43. En este trabajo, hemos comprobado que las células de glioma C6 presentan un déficit de Csk en comparación con los niveles de los astrocitos, y que cuando se restauran los niveles de Cx43 en estas células, se incrementa su expresión de Csk. En lo que respecta a PTEN, no hemos encontrado diferencias significativas en sus niveles entre las células de glioma C6 y los astrocitos, pero sí hemos observado que la restauración de la Cx43 en las células de glioma produce un aumento de los niveles de PTEN durante todo el ciclo celular al mismo tiempo que se reduce la actividad de c-Src. Además, hemos comprobado que PTEN está activa, ya que en las células que expresan Cx43 se puede observar su actividad sobre la vía PI3K/Akt. Asimismo, hemos comprobado que el silenciamiento de la expresión de PTEN en células de glioma C6 produce un aumento de la actividad de c-Src y un incremento de la proliferación celular en ambas condiciones; ambos efectos son mayores en ausencia de Cx43. Estos resultados indican que PTEN estaría participando en el efecto de la Cx43 en la actividad de c-Src y en la regulación del ciclo celular en estas células. Además, hemos encontrado colocalización entre la Cx43 y PTEN en células C6 mediante microscopía confocal y hemos observado que estas proteínas interaccionan entre ellas y con c-Src mediante inmunoprecipitación. Asimismo hemos comprobado que esta interacción se da también en células sanas (astrocitos) mediante inmunoprecipitaciones recíprocas y análisis de microscopía confocal. Estos resultados son de gran relevancia, ya que quieren decir que PTEN y Cx43 interaccionan cuando se expresan de forma endógena en la célula. Además, hemos estudiando las regiones de PTEN y Cx43 necesarias para la formación del complejo entre Cx43, PTEN y c-Src. Igualmente, hemos estudiado el efecto de Csk en la proliferación de las células de glioma C6 y su interacción con c-Src y la Cx43 en células de glioma y astrocitos. Nuestros resultados de pérdida de función de Csk muestran que Csk inhibe la proliferación de las células de glioma C6 y que participa en el efecto antiproliferativo de la Cx43. Asimismo hemos estudiado el efecto de la pérdida simultánea de función de Csk y PTEN y hemos observado que la pérdida de expresión de ambas enzimas contrarresta el efecto inhibitorio de la Cx43 sobre la proliferación celular. También hemos comprobado que Csk interacciona con PTEN, Cx43 y c-Src tanto en células de glioma C6 y astrocitos mediante microscopía confocal e inmunoprecipitación. Estos resultados nos hacen pensar que Csk está implicada en el mecanismo por el que la Cx43 regula la actividad de Src en estas células. En resumen, nuestros resultados apoyan nuestra hipótesis de que la interacción entre la Cx43 y c-Src produce el reclutamiento de PTEN y Csk, que estabilizarían a c-Src en su forma inactiva.