Perfiles de expresión genómicaNuevo enfoque diagnóstico para la sepsis en recién nacidos menores de 1500 gramos

Resumo

Introducción: La disponibilidad de marcadores de sepsis precoces y fiables que permitan anticiparse al resultado del hemocultivo continúa siendo un reto. Los perfiles de expresión genómica determinan los cambios de expresión de todo el genoma a partir de una pequeña cantidad de sangre usando una biochip. Aunque en pacientes adultos y pediátricos se han obtenido resultados prometedores con genes candidatos para marcadores de sepsis, no hay estudios equivalentes en la sepsis neonatal. Objetivo: Determinar si existen perfiles de expresión genómica específicos que diferencien recién nacidos de muy bajo peso (RNMBP) infectados de controles no infectados. Población y Metodología: Estudio de doble cohorte, observacional y prospectivo en RNMBP. A RNBP con sospecha clínica de sepsis se les extrajo hemocultivo y 0,5 ml de sangre que se conservó en solución estabilizadora de ácido ribonucleico (ARN) previo inicio de antibiótico. Consideramos sepsis aquéllos en los que se aisló un microoganismo en hemocultivo. Se seleccionaron controles apareados por características clínicas y demográficas, a los que también se extrajeron 0,5 ml sangre. Se aisló el ARN a partir de las muestras y se hibridaron sólo las muestras con una integridad y pureza de ARN adecuadas usando la plataforma de microarrays Human Gene 1.0 ST (Affymetrix®). Los perfiles de expresión se obtuvieron con el software Partek Genomic 6.6 (Partek Inc®) y el análisis estadístico descriptivo con SPPS 17.0 (SPSS Inc®). Se realizó un modelo predictivo con regresión de mínimos cuadrados parciales con análisis discriminante (PLS-DA: Partial Least Squares Discriminant Analysis, MatLab®) y los genes más significativos se validaron con reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real combinada con una reacción de retro-transcripción (RT-PCR) usando sondas TaqMan® (Applied Biosystems). Se utilizó además una cohorte de validación externa con nuevos casos y controles. Resultados: Se analizaron 17 casos y 19 controles con características clínicas y demográficas similares. Se aislaron: S. coagulasa negativo (10), E. coli (3), E. faecalis (2), S. aureus (1) y M. morgagnii (1). Se observaron diferencias de expresión entre los dos grupos con 554 genes significativos con Fold Discovery Rate ?0.05 en el ANOVA. El análisis no supervisado (Principal component analysis) objetivó diferencias de expresión entre: controles, sepsis por bacterias Gram positivas y sepsis por bacterias Gram negativas. El modelo predictivo con PLS-DA mostró 9 genes con una muy buena capacidad de clasificación: CD177, MMP8, OLFM4, HP, GSTM1, LCN2, ANKRD22, CEACAM1 y GPR84. Los procesos biológicos más significativamente implicados fueron la respuesta inmune innata y la respuesta inflamatoria y los reguladores cuyas redes explicaron más genes: el factor de necrosis tumoral (TNF), las citoquinas y el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-kB). Se analizaron las diferencias entre las sepsis por bacterias Gram positivas y por bacterias Gram negativas en la cohorte de sepsis. El análisis no supervisado mostró 2 grupos diferentes en función de la expresión a partir de 719 genes significativos y el modelo predictivo 23 genes con una gran capacidad de clasificación. Se validaron los resultados con un test de permutaciones múltiples y doble validación cruzada. Conclusiones: Los perfiles de expresión genómica permiten discriminar a los RNBP con sepsis de los controles no infectados. Se han identificado y validado los genes más significativos que podrían ser futuros marcadores. Se han observado diferencias de expresión genómica entre las sepsis por bacterias Gram positivas y Gram negativas.