Estudio transversal de la microbiología salival mediante pirosecuenciación en escolares de la Comunitat Valenciana y su relación con la caries dental

Resumo

La salud oral, que está fuertemente influenciada por la microbiota oral, ejerce un papel significativo en la salud general. Las comunidades bacterianas orales contienen especies que promueven estados de salud, mientras que otras contribuyen a la enfermedad. Conocer qué especies están presentes y cómo se componen las comunidades microbianas en estados de salud es el primer paso para comprender qué cambios pueden llevar a la enfermedad. El tipo de muestras a utilizar para este tipo de estudios, bien con objetivos epidemiológicos o etiológicos, es crucial. La saliva representa un medio fácil y no invasivo de obtención de muestras que contengan bacterias orales de varias localizaciones como las mucosas y la placa supra y subgingival, pero esta puede ser tomada por distintos procedimientos, como saliva estimulada con chicles estériles de parafina, saliva no estimulada con puntas de papel en suelo de boca, “spitting method”, enjuagues con solución salina estéril, etc. Los componentes salivales pueden jugar un rol en la susceptibilidad y desmineralización del esmalte, remineralización y resistencia a la caries dental, la cuál se produce al alterarse el equilibrio ecológico de los biofilms microbianos orales. Los cambios en la composición salival pueden producir alteraciones de la microflora oral en el desarrollo de la caries, y viceversa. En estudios epidemiológicos previos, se ha tomado saliva no estimulada de forma habitual como muestra representativa del ecosistema oral. El objetivo principal de la tesis fue estudiar la microbiota oral a partir de muestras de saliva no estimulada mediante pirosecuenciación de productos de PCR del gen 16S rRNA, y determinar la variabilidad interindividual entre los distintos estadíos de caries dental, y consecuentemente, de salud bucodental. Se seleccionaron 110 individuos de 12 años de edad explorados en la Encuesta de Salud Bucodental de la Comunidad Valenciana del año 2010, de forma aleatoria y siendo esta muestra representativa de la población, organizados en seis grupos según su estado de salud oral siguiendo el índice de caries ICDAS (Internacional Caries Detection and Assessment System). Se tomaron muestras de saliva no estimulada del suelo de la boca con puntas de papel depositadas en suelo de boca. Al mismo tiempo, se recogieron muestras de saliva estimulada con chicles de parafina, de las cuáles se seleccionaron 10 muestras para compararlas con las de saliva no estimulada del mismo paciente. Se realizó la extracción de ADN de las muestras; amplificaciones por PCR, con cebadores universales modificados del gen 16S RNA para bacterias (27F y 533R) a los que se les añadió previamente los adaptadores A y B del sistema Titanium del pirosecuenciador FLX de 454-Roche, permitiendo la unión de los amplicones obtenidos a las microbolas de captura así como su secuenciación. Cada muestra se amplificó mediante un cebador forward que contenía una secuencia identificativa distinta de 8 pares de bases, la cuál servía de “código de barras” para separar las distintas muestras. Ello permitió mezclar los productos amplificados de varias muestras en una sola reacción de pirosecuenciación. Los datos fueron analizados mediante la base de datos RIBOSOMAL DATABASE PROJECT, y posterior estudio estadístico descriptivo mediante el programa SPSS version 19.0. La composición de la microflora oral en la saliva de niños de 12 años está formada predominantemente por Bacilli, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Flavobacteria y Actinobacteria a nivel de clase; y a nivel de género por Actinobacillus, Streptococcus, Neisseria, Fusobacterium y Gemella. El análisis metagenómico de la microflora oral a partir de muestras salivales mediante pirosecuenciación de productos de PCR del gen 16S rRNA permite explorar la diversidad en los diferentes microhábitats, por lo que puede ser usado en la detección de poblaciones minoritarias en la microflora oral. Al analizar la relación existente entre los microorganismos orales y la caries dental se observan cambios en la composición microbiana de la saliva en función del estadío de la lesión de caries. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los subgrupos estudiados en las siguientes clases bacterianas: Bacilli, Gammaproteobacteria, Flavobacteria, Actinobacteria, Sphingomonas, Clostridia y Deltaproteobacteria; y a nivel de género en Streptococcus y Actinobacillus, Leptotrichia, Corynebacterium, Porphyromonas, Rothia, Gemella, TM7_genera_incertae_sedis, Capnocytophaga, Veillonella, Prevotella, Haemophilus, Actinomyces, Pseudomonas y Soonwooa. Existen diferencias estadísticamente significativas en la composición de la microbiota oral entre dos métodos de recogida salival (estimulada y no estimulada) de los pacientes estudiados y la biodiversidad bacteriana de la saliva no estimulada es casi tres veces menor que con la saliva estimulada. Por lo que la recogida de saliva estimulada debería recomendarse de forma taxativa en la realización de futuros estudios.