LA INHIBICIÓN DEL COMPLEJO I DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL POR EL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL A (TNFA) Y LA INTERLEUCINA-1B (IL-1B) MODULA LA APOPTOSIS EN CONDROCITOS HUMANOS EN CULTIVO

Resumo

La mitocondria juega un papel fundamental en la regulación de la apoptosis. Sin embargo, la secuencia de pasos que ocurren en la mitocondria entre el paso inicial y la regulación de la apoptosis no está definida. El TNFa y la IL-1b son potentes mediadores proinflamatorios que intervienen en la destrucción del cartílago articular. En este trabajo estudiamos el efecto del TNFa y la IL-1b sobre la modulación de las actividades de los complejos (I al IV) de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM), así como su implicación sobre el potencial de membrana (Dy) mitocondrial, la modulación de la familia de Bcl-2 y la actividad de las caspasas en condrocitos humanos. La exposición de los condrocitos al TNFa o a la IL-1b disminuyo la actividad del complejo I. Después de 48 h de exposición al TNFa o a la IL-1b los niveles de actividad del complejo I disminuyeron (TNF: 11,9 ± 1,8, IL-1b: 14,1 ± 1,6 vs basal: 19,5 ± 2,1, p < 0,05, expresado en nmoles/min/mg proteína). La actividad del resto de los complejos de la CRM (II a IV) no se modificó de forma significativa. La estimulación de los condrocitos durante 12h con TNFa o IL-1b disminuyo el Dy (por citometría de flujo) (TNFa: 35% vs basal e IL-1b:40%, p < 0,05). La expresión del ARNm de la familia de Bcl-2 y su síntesis proteica fue analizada por ensayo de protección y Western-blot. Estudios iniciales mostraron que el TNFa y la IL-1b incrementaron la expresión del ARNm de las proteínas antiapoptoticas bfl-1, mcl-1 y de la proapoptótica Bid de una forma dosis- y tiempo-dependiente. Bfl-1 y mcl-1 alcanzaron un pico máximo a las 6 h (TNFa: bfl-1 430% y mcl-1 220% vs basal; IL-1b: bfl-1 230% y mcl-1:180% vs basal). El ARNm de la proteína proapoptótica Bid incremento su expresión a las 6h (TNFa: 260% e IL-1b:280%) y mantuvo elevados niveles de expresión hasta las 72 h. Las proteínas de Bcl-2 y Bax también fueron evaluadas mediante Western-blot observándose a las 24 h un ligero incremento en la expresión de estas proteínas que fue más importante a las 72h y alcanzó niveles máximos de expresión a los 6 días de incubación (Bcl-2: TNFa 820% e IL-1b 750% vs basal, Bax: TNFa 400% e IL-1b 430% vs basal). El tratamiento con el TNFa o la IL-1b y actinomicina D (TNFa/ActD o IL-1b/ActD) estimuló la activación de las caspasas 3 y 7 de una forma tiempo dependiente, con la consiguiente ruptura de la enzima PARP. Además, el tratamiento con TNFa/ActD o IL-1b/ActD disminuyo la producción de Bcl-2 inducida por el TNFa o la IL-1b solas. La importancia de la inhibición del complejo I en la regulación de la apoptosis está abalada por la observación de que la rotenona, un inhibidor del complejo I, puede modular la apoptosis de una forma similar al TNFa y la IL-1b. Asimismo, la rotenona es capaz de inducir la expresión de COX-2 de forma similar al TNFa y la IL-1b. Estos datos sugieren que el complejo I de la CRM desempeña un papel clave en la modulación que ejercen el TNFa y la IL-1b en la apoptosis del condrocito.