Resistencia transgénica para el control del virus motoso del enanismo de la frambuesa (raspberry bushy dwarf virus-RBDV)

Resumen

RBDV se transmite en asociación con polen y por lo tanto la resistencia genética de algunos cultivares del género Rubus ha sido la única medida de control efectivo. Sin embargo, recientemente apareció la cepa viral R-15 de RBDV, la cual rompió la resistencia natural existente en algunos cultivares comerciales de frambuesa. El principal objetivo de este proyecto fue medir la resistencia   transgénica a la infección con RBDV, la cual podría conferirse mediante diferentes secuencias de genes pertenecientes a este virus, adicionalmente, otro objetivo fue entender los mecanismos moleculares de resistencia transgénica que podrían ser generados por estos genes. Para medir la resistencia transgénica a RBDV, se introdujeron siete construcciones conteniendo secuencias génicas de RBDV dentro de Agrobacterium tumefaciens mediante conjugación de la bacteria («triparental mating») y los cultivos resultantes se usaron para transformar fragmentos de hojas de Nicotiana tabacum o fragmentos de tallo de plantas de Nicotiana benthamiana provenientes de invernadero o de cultivo de tejido. Se utilizaron plantas regeneradas a partir de cultivo de tejido en medio que contenía kanamicina para obtener semillas que dieron origen a plantas de la generación F1, las cuales se evaluaron para medir su resistencia a RBDV mediante la inoculación manual de hojas jóvenes y se analizaron para determinar el título de virus mediante ELISA después de 5 y 10 días post-inoculación. Se analizaron más de 20 líneas por cada construcción y los resultados mostraron que cada transgen introducido tuvo algún efecto de protección contra el virus. De esta manera, se obtuvo evidencia de la resistencia inducida por los genes correspondientes a la cápside, la antisecuencia y la polimerasa de RBDV, los cuales dieron diferentes grados de protección. La construcción pJAD-10 (secuencia de la cápside de la cepa de RBDV R-15) generó el más alto nivel de protección entre las construcciones analizadas y algunas líneas de Nicotiana benthamiana transformadas con esta construcción mostraron inhibición o retardo en la aparición de síntomas de la infección con RBDV. Por otra parte, el resultado de la infección de líneas transgénicas transformadas con una secuencia no traducible de la cápside o con la anti-secuencia de ésta, sugiere que la resistencia puede ser generada o mediante la expresión de la proteína o por medio de transcriptos de RNAm para esta proteína. Estas construcciones están ahora disponibles para ser introducidas en frambuesa.