Análisis descriptivo y funcional de las colonias microbianas visibles que crecen en la cueva de Altamira, enfocado al diseño de medidas de control

Resumo

Este trabajo de tesis tiene como principal objetivo el estudio y caracterización de las colonias microbianas visibles que crecen en las paredes y techos de la cueva de Altamira, que constituyen una amenaza de biodeterioro para las pinturas de esta cueva. Desde un punto de vista microbiológico las cuevas, sobre todo si son cerradas, son entornos de ambiente muy estable en los que se desarrolla una microbiota, también estable, de un tipo u otro dependiendo de la disponibilidad de nutrientes. En muchas cuevas no visitadas, esta microbiota toma el aspecto de colonias visibles. Las cuevas con arte rupestre a menudo se han convertido en una atracción turística de masas, lo que supone un cambio drástico de las condiciones ambientales. Se puede introducir iluminación estable, aporte de calor, agua y CO2 de la respiración humana y eventualmente restos orgánicos que aportan nutrientes al sistema. En estas condiciones, se puede dar aportación de microbios de origen humano y se altera el equilibrio microbiológico interno, lo que puede generar condiciones de proliferación microbiana que deterioren el arte parietal. La cueva de Altamira, que ha sido objeto de visita turística muy intensa hasta finales del siglo pasado, presenta colonización por colonias visibles microbianas coloreadas, siendo posible distinguir cuatro tipos por su color: colonias blancas, grises, amarillas y beis. Su descripción comienza cerca del año 1999 y las colonias beis se detectan más recientemente, en 2018. Las colonias visibles son mucho más abundantes cerca de la entrada y su presencia se considera el principal riesgo para el biodeterioro de las pinturas. Con el objetivo de desarrollar medidas de control, hemos realizado un estudio de las colonias visibles de Altamira empleando nuevas técnicas de secuenciación masiva (técnica de amplicones y shotgun) que suponen una diferencia cualitativa en comparación con las primeras técnicas utilizadas en Altamira. Por la técnica de amplicones se han detectado más de cuatro mil OTUs, asignadas a sus taxones correspondientes. Basándonos en las abundancias relativas se aporta evidencia de la existencia en las colonias de unos componentes predominantes (uno o dos por colonia), al menos 20 veces más abundantes que el resto, a los que hemos denominado componentes mayoritarios (CMs) y que son característicos en cada colonia. Estos componentes más abundantes, que por la técnica de amplicones resultaron ser tres, clasificaron dentro del filo Actinobacteria con la familia Euzebyaceae (OTU1) y el género Crossiella (OTUs 2 y 4). Su distribución desigual en las colonias han sido la base para diferenciar en 2 subtipos a las colonias grises y blancas. Esta heterogeneidad detectada en algunas muestras de colonias aparentemente del mismo color no se ha mencionado anteriormente en otros estudios, indicando que la clasificación por color no es suficiente para describir la diversidad de las colonias. Muchas de las OTUs detectadas presentaron abundancias relativas muy bajas o presencia en muy pocas muestras por lo que probablemente representen bacterias del soporte que se arrastra con la toma de muestras. Por ello se seleccionó un core de 36 OTUs que representan los componentes más frecuentemente encontrados dentro de los distintos tipos de colonias de Altamira. En esta selección de core, destacaron las OTUs correspondientes a los CMs y un componente secundario (OTU3) compartido en casi todas las muestras con menor abundancia. La OTU3, asignada taxonómicamente a la clase Gammaproteobacteria y orden Wb1-P19 con la base de datos de SILVA, filogenéticamente se agrupa con el orden Chromatiales y es detectado con regularidad en ambientes de cueva. Con la técnica de shotgun se han obtenido secuencias de DNA total de los seis tipos de colonias identificados por la técnica anterior. Se obtuvieron por esta técnica 90 borradores de genomas (MAGs) todos ellos pertenecientes a bacterias (88) y arqueas (2). La presencia de unos componentes mayoritarios se confirmó también por este enfoque. El número de componentes finales que se recuperó por colonia fue similar al core descrito con la anterior técnica y que osciló entre 6 y 34 MAGs, siendo las colonias grises (ambos subtipos) las más complejas de todas. Los taxones que se encontraron en los MAGs recuperados de las colonias fueron Acidobacteria, Actinobacteria, Candidate division NC10, Candidatus Dadabacteria, Candidatus Rokubacteria, Chloroflexi, Parcubacteria, Proteobacteria (alpha, beta, gamma y delta), Nitrospirae y Thaumarchaeota. La asignación taxonómica de los CMs no mostró una buena coincidencia con las referencias disponibles indicando que estos componentes representan una novedad en la taxonomía de las Actinobacterias. Los CM serían de dos tipos, constituyendo uno de ellos un nuevo género candidato dentro de la familia Pseudonocardiaceae con la probable presencia de 5 especies distintas y el segundo un nuevo orden candidato con dos especies distintas en la clase Nitriliruptoria. Los borradores de genomas de alta calidad que proporciona esta tesis ofrecen la única información disponible sobre las capacidades nutricionales de estos “nuevos” taxones. Al comparar las secuencias de los componentes de las colonias con las bases de datos encontramos que los homólogos a los CMs provienen de estudios de suelos o de colonias de cuevas, lo que indica que estos nuevos taxones contienen bacterias adaptadas y específicas de cuevas no encontrándose entre ellas bacterias de posible origen humano. A partir de las secuencias, hemos predicho las funciones metabólicas y fisiológicas presentes en los metagenomas de las colonias visibles para hacer una predicción de su capacidad funcional. Destaca la abundancia de genes involucrados en procesos del metabolismo y transporte, y concretamente, la presencia de genes capaces de soportar un crecimiento quimioautótrofo basado en la fijación de CO2 y la oxidación de compuestos como hidrógeno, monóxido de carbono, amonio, etc. Este hallazgo sugiere que además de una forma de vida heterotrófica basada en compuestos orgánicos aportados por el agua de infiltración, las colonias podrían crecer de forma autotrófica en épocas de baja disponibilidad de materia orgánica. En los análisis llevados a cabo de las comparaciones de los diferentes tipos de colonias de Altamira, hemos podido observar un modelo general de composición de colonia aplicable a las colonias de Altamira y probablemente a cualquier biofilm similar formado en cuevas. Finalmente, la obtención de borradores de buena calidad de los componentes predominantes en las colonias ha permitido el desarrollo de primers específicos contra estos componentes, y con ellos, de ensayos de PCR que detectan de una manera directa rápida, sencilla y poco costosa la presencia de dichos componentes. Estos ensayos de detección suponen una mejora sustancial en los métodos de seguimiento microbiológico del biodeterioro de cuevas y otros bienes culturales. Igualmente, la información genómica aportada en esta tesis puede ser la base para diseñar medidas de control eficaces para combatir eventuales problemas de biodeterioro causado por colonias visibles.