Internal translation of truncated gap junction proteins in health and diseasegeneration, regulation and function

Resumen

En los seres humanos las Conexinas son una familia de 21 proteínas gap y forman canales para la comunicación intercelular permitiendo el intercambio directo de moléculas de bajo peso molecular entre células adyacentes. Esta es una característica esencial para el desarrollo de los tejidos y la homeostasis, lo cual está frecuentemente desregulado en enfermedades y durante el desarrollo del cáncer. La proteína de unión gap más ampliamente expresada es la Conexina 43 (Cx43), que además posee varias funciones que no dependen de la capacidad de formar canales. Entre las cuales se encuentran el control de la migración celular, lo cual está regulada por el dominio citoplasmático terminal (CTD). Nuestro laboratorio y otros han demostrado que la Cx43 produce proteínas truncadas por el extremo amino (NT) las cuales pueden ser directamente traducidas a partir de un solo transcrito de mRNA codificado por el gen GJA1. El objetivo de este proyecto fue obtener mayor información sobre el mecanismo de traducción interna de Cx43, su regulación, y las posibles funciones de las formas truncadas, y finalmente proveer evidencia de la importancia general de la traducción interna en la familia de genes de las conexinas. Mostramos que el contexto de la secuencia Kozak de GJAl, que la región que rodea al codón de inicio AUG regulan la eficiencia de inicio de traducción de la proteína de tamaño completo (FL) Cx43 mediante un proceso de "leaky ribosomal scanning". En presencia de una secuencia Kozak "débil", la expresión de FL-Cx43 se reduce, con un incremento concomitante de las formas truncadas de Cx43. La remoción del primer codon de inicio de traducción FL-Cx43 AUG, o la introducción de una mutación fuera del marco de lectura generan un codón de parada prematuro ubicado a 15 pares de bases pair (bp) del inicio, bloquean completamente la traducción de FL-Cx43 pero aumentan significativamente la expresión de las formas truncadas. Nos enfocamos en la traducción de la forma truncada más importante de la Cx43, denominada GJA1-20k, ta cual migra con un tamaño de alrededor de 20 kilodaltons (kDa). El sitio de inicio de traducción propuesto para GJA1-20k es un codón AUG ubicado entre bp 637-639 de la región codificante (CDS), y corresponde a la metionina 213 (M213) de la Cx43. Una versión truncada de Cx43 que carece de las bp 1-444 de la CDS aún traduce GJA1-20k. Deleciones adicionales dentro de la CDS de Cx43 fueron creadas para identificar si posibles secuencias o Sitios Internos de Entrada de Ribosomas (IRES) corriente arriba de GJA1-20k son críticas para su traducción. Sorprendentemente, detectamos la expresión de GJA1-20k a pesar de delecionar desde bp 296 hasta bp 672 (pasando el sitio de inicio AUG propuesto en bp 637-639). La expresión de GJA1-20k no se detectó cuando delecionamos hasta bp 675 o más. Nuestros resultados no concuerdan con la idea de que un !RES se pueda encontrar en la región codificante de Cx43 corriente arriba del sitio de inicio de GJA1-20k, lo que sugiere que la forma altamente expresada GJA1-20k (o una proteína de una tamaño muy similar) puede ser sintetizada mediante un codón interno no usual o mediante un mecanismo de traducción que no requiere un AUG (traducción no-AUG). En efecto, el análisis por western blot de células transfectadas con un plásmido en el cual los 7 codones AUG de la Cx43, localizados en el mismo marco de lectura fueron mutados, reveló una única banda de un tamaño de alrededor de 20 kDa. Realizamos numerosas mutaciones puntuales dirigidas en la región entre bp 760-780 pero no fuimos capaces de Identificar en sitio putativo exacto de inicio de traducción no-AUG GJA1-20k. Además, la secuenciación N-terminal usando proteína Cx43 inmunoprecipitada no identificó a GJA1-20k ni su sitio de inicio N-terminal aun ue se detectaron numerosas proteínas que se unen a Cx43. Analizamos la influencia de las regiones no traducidas S' y 3' (UTRs) de GJAl. La presencia del S'UTR, sugerido por poseer un IRES, claramente disminuye la expresión de FL y las formas truncadas de la Cx43, contradiciendo la actividad de un IRES. Esta inhibición fue parcialmente aliviada por la presencia del 3'UTR, aunque diferencias específicas del tipo celular fueron identificadas. Analizamos el estado de la fosforilación de GJA1-20k. La fosforilación parece ser dependiente de la presencia de FL-Cx43 aunque la Interacción directa de estas observaciones no fue estudiada. Usando la línea celular de cáncer de pulmón A549 y la línea celular embrionaria de riñón HEK293 obtuvimos evidencia clara de la presencia de Cx43 en el núcleo mientras que GJA1-20k no se encuentra en esta fracción celular. En contraste, cuando sobre-expresamos GJA1-20k en HEK293T detectamos altos niveles de la proteína en la fracción mitocondrial. Para identificar los roles funcionales de GJA1-20k, realizamos ensayos de formación de colonias y migración celular. Usamos retrovirus para expresar de manera estable Cx43 y GJA1-20k en la línea celular de cáncer de mama MCF-7. Las dos FL-Cx43 y GJA1- 20k causaron una disminución en la capacidad de formar colonias. Las líneas celulares de cáncer de mama BT549, SUM159 y la línea celular de cáncer cervical C33a, mostraron una mayor capacidad de formar colonias después del knockout (KO) de Cx43 mediante CRISPR-Cas9. Además, las dos líneas BT549 y SUM159 adquirieron un fenotipo migratorio mayor en las células Cx43-KO. Finalmente, de los 21 genes humanos de conexinas, seleccionamos algunos candidatos para verificar si la traducción de proteínas truncadas podría ocurrir. Clonamos Cx26, Cx30, Cx31, Cx31.1, Cx32, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, y Cx46 y añadimos un tag general Myc-tag en el extremo carboxilo-terminat (CT). Mediante western blot múltiples bandas de menor peso molecular pudieron ser detectadas en todas las conexinas, muchas de las cuales corresponden a formas truncadas predichas in silico mediante análisis bioinformático. Evidencia que apoya el resultado de inicio de traducción interna y no la ruptura de la proteína, se obtuvo al delecionar el primer codón de inicio pata prevenir la síntesis de la proteína FL. En todos los casos, la ausencia del primer AUG provocó la pérdida de la proteína de tamaño completo, pero la expresión de las formas truncadas fue en general mantenida o aumentada. La modificación de la secuencia Kozak de Cx45 sugirió que el leaky ribosomal scanning regula este proceso de manera similar que a lo descrito para Cx43. También obtuvimos evidencia en cuanto a mutaciones específicas de un solo nucleótido y cómo podrían influenciar la síntesis de las proteínas truncadas. En conclusión, esta tesis muestra que la síntesis de formas truncadas de Cx43 parece ser !RES-Independiente y es principalmente regulada por leaky ribosomal scanning. La traducción de la forma principal de GJA1-20k, o una versión muy similar de GJA1-20k, puede ser mediada por un sitio de inicio no-AUG ubicado a 30-40 bp después del sitio de inicio putativo M213 (bp 637-639). GJA1-20k regula ciertas características fenotípicas en células de cáncer, pero presenta un tropismo inusual a la mitocondria, lo cual garantiza estudios adicionales. Finalmente, nuestro análisis de los otros 10 miembros de conexinas sugiere que la síntesis de formas truncadas de conexinas mediante un mecanismo de inicio de traducción interna puede ser una característica común en los genes de esta familia de proteínas.