Identificación de hongos filamentosos y levaduras de interés clínico mediante espectrometría de masas MALDI -TOF

Resumo

Las infecciones fúngicas están asociadas a una elevada morbi-mortalidad y se han incrementado en las últimas décadas debido principalmente a los avances en la medicina y las nuevas terapias. Estos avances han permitido una mayor supervivencia de pacientes susceptibles a las infecciones causadas por estos microorganismos. Sin embargo, la aparición de especies crípticas, que muestran susceptibilidad reducida a los antifúngicos, complica el manejo de estos pacientes y pone de manifiesto la importancia de disponer de herramientas rápidas y precisas de identificación que adelanten el diagnóstico y que permitan establecer un tratamiento adecuado y rápido de los pacientes. La espectrometría de masas MALDI-TOF, ha emergido como una herramienta de identificación rápida para un gran número de microorganismos. Sin embargo, su aplicación es limitada en el caso de los hongos filamentosos debido a: 1) la falta de protocolos estandarizados de procesamiento de muestras; y 2) las limitadas bases de datos específicas. Las bases de datos comerciales para la identificación de hongos filamentosos cuentan con un número muy limitado de espectros de referencia para las especies fúngicas con mayor relevancia clínica. Debido a los constantes cambios taxonómicos, así como la descripción de nuevas crípticas, es necesaria una actualización frecuente de las bases de datos de hongos filamentosos. Estas razones fueron el motor para el desarrollo de esta tesis en el que se evaluaron dos sistemas de espectrometría de masas - MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Alemania) y Vitek MS (bioMérieux, Francia) - para la identificación de aislados pertenecientes a los géneros Aspergillus, Fusarium, Scedosporium, el orden Mucorales, dermatofitos, y levaduras del complejo Cryptococcus neoformans y la creación de una base de datos ampliada y mejorada. En esta tesis doctoral se aplicó un método sencillo para la preparación de muestras que ha demostrado ser efectivo para la obtención de espectros de proteínas de alta calidad. Este método de preparación de muestras permitió identificar más del 90% de los aislados, con elevada fiabilidad. Se creó y evaluó una base de datos interna que incluía los espectros de las principales especies de hongos con interés clínico (Hongos filamentosos y Levaduras HGM). La validación interna de esta base de datos permitió la identificación a nivel de especie de la práctica totalidad de los aislados analizados (96,6% - 99,0%). También se realizó una validación externa de la base de datos en tres hospitales nacionales, que lograron una identificación precisa de más de 84,0% de los aislados analizados. Estos resultados demuestran que la base de datos creada es una herramienta eficaz y universal para la identificación rápida de hongos filamentosos. La mejora de la base de datos junto con herramientas de análisis basadas en Machine Learning para clasificar espectros proteicos obtenidos mediante MALDI-TOF permitió lograr una mayor discriminación de grupos de microorganismos estrechamente relacionados e indistinguibles. Esta metodología se empleó para la discriminación de las especies Cryptococcus neoformans, C. deneoformans y la especie híbrida que forman entre ellas, obteniendo la correcta discriminación en el 100% de los casos con el algoritmo de análisis PLS-DA. Esta aproximación también se empleó para la discriminación de las diversas especies crípticas del complejo Fumigati, y para diferenciar entre aislados de A. fumigatus sensu stricto sensibles y resistentes a azoles, obteniéndose un 100% y un 98,5% de clasificaciones correctas, respectivamente. Por último, se evaluó el sistema de espectrometría de masas Vitek MS (bioMérieux) para la identificación de hongos filamentosos. Esta herramienta permitió la identificación del 88,5% de los aislados, siendo la gran mayoría identificados a nivel de complejo. Estos resultados sugieren la necesidad de una mejora de la base de datos para el Vitek tal y como recomiendan otros autores.